生物技術和生命科學將成為 21世紀引發新科技革命的重要推動力量，人類所面臨的健康、疾病、食品、醫藥制造、能源、環境等一系列問題成為這一時期最重要的內容。以微生物發酵技術為核心的新一代工業生物技術正在發揮越來越重要的作用，功能菌株（高產菌種）的構建與大規模篩選技術被列為重點研究的新一代工業生物技術之一。
1、國內外菌種生產水平存在差距
全世界微生物發酵產品市場規模約為 200億美元，其中抗生素占 46%，從世界趨勢看，抗生素市場正以 8%的平均年增長率高速發展，而我國市場每年的增長更是超過 20%。幾大抗生素品種的原料藥生產主要集中在我國。如我國青霉素年產量超過 6萬噸，占世界份額約 90%，原料藥銷售中有超過 60%為出口。再如維生素 C全球產能超過 13萬噸，需求量一般保持在 9萬噸左右，主要由六大企業掌控：石家莊制藥集團、華北制藥集團、東北制藥集團、江山制藥有限公司以及荷蘭帝斯曼公司和德國巴斯夫公司。而國內四大企業產能已經超過 9萬噸，中國已成為全世界維生素 C供應商主要基地，中國維生素 C出口的國家和地區超過 150個。我國已經成為名副其實的發酵大國，但是由于種種原因，我國的發酵技術水平仍處于落后地位，其中菌種的發酵水平與國外先進技術相比有相當大的差距。如青霉素國外菌種發酵效價為每毫升發酵液近20萬單位，而我國目前只有 10萬單位左右；紅霉素發酵能力國際上已經超過 1.5萬單位 /mL，國內最高水平僅有8000～ 10000單位 /mL。我國其他發酵產品的菌種生產能力基本上都同樣面臨落后于國際水平的局面。因此，提高工業生產菌種的發酵能力是提升我國發酵工業整體水平的重要基礎。
2、我國菌種選育技術發展現狀
常用的菌種選育技術（ strain improvement）根據其原理可分成隨機選育（ random screening）和理性選育（rationalized selection）兩大類 ①。雖然以分子生物學為基礎的基因工程、代謝工程以及由各種組學組成的系統生物學研究為定向構建功能細胞株提供了廣闊前景，但要真正實現以這些功能細胞培養來達到改造目標卻極其困難。由于微生物體內代謝網絡的復雜性和多結點性，基因操作后菌株的代謝流往往并不朝著預期設計的方向轉移。尤其是在產生抗生素等次級代謝產物的復雜體系中，要想得到優良的工業生產菌株，主要還是采用隨機選育技術，包括自然選育、誘變育種和以原生質體融合為代表的雜交育種技術，但篩選工作量大，費時費力。這是因為產量的高低屬于數量性狀，遺傳學上由多基因決定，一次誘變和篩選很難有大幅度提高，需要多輪誘變篩選才能逐漸積累到一定的高產特性，這一點不同于以發現化合物為目標的菌種篩選。因此從菌種選育實踐來看除了一些用代謝工程方法改造的初級代謝產物生產菌株外，不論采用隨機選育還是理性選育，都無法繞開大量繁瑣的菌株篩選工作 ② 。另一方面，無論是隨機選育還是理性選育，經典的菌種初篩和復篩都是在沒有任何檢測參數的搖瓶或試管中進行的，篩選過程微生物的外在培養環境與工業發酵生產存在巨大反差，很多真正符合實際生產環境、性狀優良的菌種往往在篩選初期就被漏篩掉了 ； 菌種篩選和篩選后發酵工藝設計與優化工作是分開、順序進行的，兩者之間缺少技術參數的聯系，導致搖瓶篩選到的優良菌株與實際工藝條件產生不對應性，因而許多優良菌株的高產性能很難在工業生產中體現出來。這種篩選模式在我國沿用了半個多世紀而沒有明顯改進。由此可見，在菌種選育領域，亟需開展多參數的與發酵工藝過程相結合的高通量菌種篩選技術和方法的研究。
3 、高通量菌種篩選的國際研究進展
近幾年用于微生物菌種高通量篩選（high-throughput screening）的裝置及相關技術不斷發展和成熟 ③～ 。國外發明了多種全自動高通量篩選系統，可以進行培養基滅菌、 倒平板、 挑取單菌落、分裝發酵培養基、接種、抽提、HPLC（高效液相色譜）分析和數據自動收集處理等過程，即組合成一套連續的自動化系統，實現高效自動化篩選，從而大大提高篩選效率。國際上菌種篩選技術正朝著高通量、微型化、自動化和儀器化方向發展，其中生物反應器微型化是當前發展的重要趨勢。如美國馬里蘭大學、 麻省理工學院、 德國雷根斯堡大學、英國倫敦大學等都在加緊開發具備高通量特性的微型生物反應器 ③ ~ ⑧ ，有些產品已經在不少大型制藥公司得到商品化應用。
3.1 微型生物反應器
目前國際上出現的微型生物反應器在結構上大體包括三類 ： 孔板式微反應器（microtiter plate，MTP，參見圖 1） ④～⑥ 、基于現有搖瓶或發酵罐原型縮微化的分體式微反應器（miniature bioreactor，MBR，參見圖 2） ⑦ 和微流控芯片實驗室（microfluid-based lab-on-a-chip，參見圖 3） ⑧～⑩ 。微型生物反應器雖然形式各異，但都具有以下功能和特點 ： ①多參數在線檢測功能，可同時測量 pH 值、DO（dissvloed oxygen，溶解氧） 、 P co 2 、OD（optical density，光密度）等重要參數 ； ②高通量分析功能，在一臺微反應器上集成的微發酵罐數可達 6、12、24、48、96 個不等 ； ③體積小，其體積一般小于 100 mL，有的甚至小至 5mL ，微流控芯片則為 nL 級規模。此外，還有造價低、減少昂貴原材料消耗、降低勞動強度等優勢。生物反應器的微型化主要是基于光化學傳感技術在發酵中的成功應用。光化學傳感器的測定原理是 ： 特定波長的激發光照射到事先加入培養基內的某種熒光染料指示劑或固定于生物反應器內壁上含有熒光染料指示劑的（patch，即化學傳感器）上（參見圖 4） ，指示劑產生發射光或光吸收，并被檢測器檢測到，根據培養基內氧氣或二氧化碳含量的不同（或 pH 值變化） ，檢測到的熒光強度也不同，據此而定量溶液中的 DO、P co 2 或 pH 值。與過去基于電化學原理設計的傳感器不同，光化學傳感器是一種非接觸式傳感器（non-invasive sensor） ，因此最大程度地減少了在線檢測對發酵狀態的干擾，也解決了染菌問題 ，且便于縮小反應器。而且光化學傳感器成本低廉，其費用為傳統電化學電極的1/20 ～1/10。
3.2 孔板式微反應器（MTP）
微孔板是自動高效篩選的標準方式 ： 篩選自動化，結果定量化，可與自動化機械、液體處理系統、光學讀板儀等相匹配。MTP 有各種格式可提供（6~1536孔） ，但 24 孔、48 孔和 96 孔格式是最常用的。MTP 最先是在分析領域得到 應用，現在廣泛應用于組合化學、生物轉化、 微生物發酵和細胞培養篩選研究。美國 Biolog 公司開發了一種表型分析微陣列（phenotype microArray，PM）系統。該系統可以同時提供 2000 多種不同的培養條件，用以檢測微生物的生長、呼吸、代謝等不同的表型。該高通量培養系統包含了 200 種碳源、400 種氮源、100 多種磷源和硫源、100 種營養補充劑以及不同范圍的 pH 值、滲透壓、離子濃度等生長環境。通過這些預設的生長條件，可以實現對不同品系細胞或突變體的生理特性或遺傳特性的快速和高通量檢測。目前，該系統已經成功地在數千種不同的細菌、真菌、哺乳動物細胞的表型快速篩選中得到了成功應用。這對藥物開發、微生物檢測、食品安全等相關領域產生了巨大的影響力。M24 是一個深孔板格式的微型反應器系統（參見圖 1） ，包含 24 個圓柱形無擋板的深孔（微反應器） ，工作體積為5mL。每個孔內配置了非接觸式 pH 值、DO 和溫度傳感器、熱導體、0.2mm 噴氣膜（可透過混合空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳和氨，參見圖 4） 。每個孔上端用透氣帽密封，起到隔菌的作用。M24 深孔板可置于溫育箱中培養。Chen 等首次報道了用 M24 作為常規實驗室規模發酵罐的縮小模型進行動物細胞懸浮培養工藝開發。考察了 pH 值、DO 測量、溫度控制的精度 （參見圖 5 和圖 6） 。從 pH 值、DO、溫度、細胞生長、產物形成和蛋白質量參數方面與 2L 工作體積的常規臺式反應器進行了比較，結果顯示有很好的一致性，說明該系統適合作為細胞培養過程研究的縮小模型應用。
3.3 分體式微型生物反應器（MBR）
Harms 等報道了一種 24 位分體式MBR 系統（參見圖 2） ，每個反應器的工作體積為 1mL。除為每一個微型反應器配備獨立的非接觸式在線 DO、pH 值傳感器外，還安裝了由步進電機驅動的攪拌控制，最大可以提供 1000 r/min 的轉速。這個系統的優勢是每個微型反應器可以滅菌、允許放在凈化臺上操作、各個反應器可以控制不同的轉速。該系統在 E.coli 發酵中表現出很好的 DO、pH值、OD 的重現性和控制 DO 的可能性。Ge 等報道 12 個微型發酵罐組成的 MBR系統，微反應器的直徑是 30mm，高度為 78mm，工作體積大約為 30mL（參見圖 7） 。每個反應器底部同樣配備了傳感器，以SP20/0 骨髓瘤 / 鼠雜交瘤細胞系為試驗對象，通過轉錄分析表明光傳感系統不影響細胞生理特性。
3.4 微流控芯片系統
近年來微流控技術的發展為微生物用 PMMA 制作了一種可實現 OD、pH值和溶解氧實時監測的微流控連續發酵反應器 ⑧ （參見圖 3） 。Groisman 等利用PDMS 加工制作微腔陣列作為高通量的微生物發酵反應器 ⑨ ，該芯片通過在相鄰的微腔之間設計壩形結構將微生物細胞群體限制于各微腔內生長，同時保證液體通過壩形結構在各微腔中的流動，實現營養物質的更新和代謝產物的移出，該微型發酵反應器可以簡單地實現高通量的微生物連續發酵。Zhang 利用該發酵芯片進行了大腸桿菌和酵母細胞的高密度培養實驗以及單細胞生長監測實驗。不過，該發酵芯片功能過于簡單，僅包含菌種導入和營養物質更新功能以及一個可調節因素 —— 溫度，與實際發酵控制過程相差較遠。且該芯片無法避免細菌生物薄膜（biofilm）的形成（細菌生物薄膜會消耗大量生長底物） ，難以保證發酵反應器發酵工作的長期有效性和穩定性。加州理工學院的Balagaddé 等利用多層軟光刻技術制作了一種基于半連續發酵方式的微流控發酵反應器 ⑩ ，該芯片包含 6 個獨立平行運行的 16 nL 發酵單元，每個單元通過精細設計和密集排列的微通道、微閥和微泵來實現微生物發酵過程中的多步處理過程。每個發酵循環操作除了不斷灌注營養物質和排出發酵液外，還涉及一個裂解液灌注、清洗的操作，該操作可防止發酵芯片管壁上形成細菌生物薄膜，保證發酵芯片長期工作的有效性和穩定性。雖然該芯片具有較完善的功能，但是通量較低（僅 6 個獨立單元） 。隨著微型化技術的出現，微流控裝置的開發顯著增長。研究表明微流控系統在提高分析性能、降低實驗室安全要求、降低成本，縮短分析時間和減少試劑用量方面是非常有前景的 
3.5 機器人系統
機器人系統從 20 世紀 90 年代后首先開始在化學和藥物領域中用于開展化學分析，后來對標準的實驗室自動化方案進行適當修改，用于工業發酵工藝開發。不同于在生化分析研究中的應用，微生物培養對機器人系統有一些特殊要求，比如足夠的氧供應、適宜的生長溫度控制、盡可能小的樣品蒸發以及避免交叉污染和簡單可靠的過程控制。圖 8 是 基 于 Sagian Core System 和SAMI 3.3 控制軟件（Beckman-Coulter，Fullerton，CA） 集 成 的 自 動 化 高 通量發酵系統 ，整個機器人系統被安裝在一個封閉的箱體內，箱體尺寸是4.9m×2.3m×2.2m。整個箱體有溫濕度控制，并集成了頂部中央軌道機械手、條形碼閱讀器、蓋板站、封板器、液體處理裝置、搖床、光度計、離心機、冷藏室等。這個自動化系統可以在沒有手工介入的情況下平行地實現樣品準備、運行、監控 768 個（16 個 48 孔板）好氧微型化發酵實驗，雖然期間因采用了
半連續熒光檢測技術而要求短暫的停止震搖，但這并不明顯影響細胞培養實驗結果。該系統以 E.coli 和 Saccharomyces
cerevisiae 為培養對象進行了功能驗證，
4、展 望
就我國科研單位和企業的經濟實力而言，近期甚至將來很長一段時期內尚無法推廣國外這些價格高昂、自動化程度高的高通量篩選設備，因此自主研發基于微反應器的高通量工業生產菌種的篩選技術和裝置是提高我國功能菌株大規模篩選技術的必經之路，形勢刻不容緩，否則會造成與國外菌種技術差距越來越大。可喜的是國內開展了這方面的研究開發工作 ，上海百侖在微型生物反應器及多通道生物反應器的研究與制造方面走在前沿
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